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数字PCR技术发展简史
作者:管理员    发布于:2020-06-03 21:40:58    文字:【】【】【
摘要:数字PCR技术被称为第三代PCR技术,其问世才不到三十年,但发展迅速。本文梳理了数字PCR技术的重要进展,为读者了解数字PCR技术及商业化进展提供思考。

1992年,Sykes等从非淋巴细胞和正常体细胞背景中鉴定突变的白血病细胞,检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因。该研究中提出了三个重要的原则:有限稀释、终点信号的有或无及对数据泊松分布的统计处理,为以后dPCR的发展奠定了基础。

  1997年,有研究利用玻璃毛细管作为载体进行PCR反应,可以对模板分子进行定量,验证了Taq-Man探针可以检测模板单分子,尤其在微小的反应体系中,发展了单分子定量技术,为dPCR单模板扩增提供了技术支持。

  1999年,Bert Vogelstein和Kenneth W.Kinzler正式提出了dPCR的概念,可以将指数型函数转化成线性函数,对模板进行有限稀释,根据荧光信号的有或无进行精确定量。实验利用384孔板对样品进行稀释、扩增,来检测结、直肠癌粪便样品中c-Ki-Ras基因突变,对数据进行泊松分布的处理。研究还提出了数字PCR的另外一个优势,由于粪便样本中含有大量的PCR反应抑制剂,通过对样品进行稀释,提高了对反应抑制剂的耐受程度。

  2003年,Devin等提出了BEAMing技术,包括小珠(Bead)、乳浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性(Magnetic)。利用包被链霉亲和素的磁性珠子和生物素标记的寡核苷酸,形成微乳液,进行PCR扩增,通过流式细胞仪检测荧光标记来进行计数,这个技术为以后微滴式dPCR的产生提供了技术依据。

  2006年,Fluidigm公司第一个生产商业化的基于芯片的dPCR仪,主要包括EP1系统和BioMarkHD系统。

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BioMark HD系统

  2009年,Life Technologies推出了OpenArrayQuantStudio 12KFlex dPCR系统。

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QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System

  2013年,Life Technologies又推出了QuantStudio 3D dPCR系统,采用高密度的纳升流控芯片技术,将样本均匀的分配至20000个单独的反应孔中。

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QuantStudio 3D数字PCR系统

  2011年,Bio-Rad 公司推出了基于微滴的QX100 dPCR仪,利用油包水技术,将样品平均分配到20000个微滴油包水中,利用微滴分析仪对微滴进行分析

  2013年,Bio-Rad公司推出在QX100基础上的升级QX200 dPCR仪。

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QX200 微滴式数字PCR系统

  2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR 仪,在高压气体驱动下,将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液,提高了dPCR仪的检测范围,适于检测浓度差异较大的样品。

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RainDrop™数字PCR(dPCR)仪

  到目前为止,dPCR的扩增载体从多孔板、毛细管发展到目前的芯片和微滴,降低了反应成本,提高了PCR反应的分液数目和实验的灵敏度。

  2013年,Life Tech发售QuantStudioTM™3D数字PCR系统。不同于伯乐的微液滴数字PCR系统,这款QuantStudioTM 3D数字PCR系统采用硅基材料纳升微孔板芯片技术。

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QuantStudioTM 3 D芯片数字PCR系统

  2016年,Stilla Technologies推出Naica crystal微滴数字PCR系统,旨在为专门从事分子生物学的研究机构精确定量DNA突变。

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Naica crystal微滴数字PCR系统

  到目前为止,dPCR的扩增载体从多孔板、毛细管发展到目前的芯片和微滴,降低了反应成本,PCR反应的分液数目和实验的灵敏度也更高。