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时间分辨荧光分析法
作者:管理员    发布于:2014-06-26 04:23:56    文字:【】【】【
摘要:  时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术,是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10^(-12)g/ml[1] ,较放射免疫分析(RIA)高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。由于其高灵敏度,在临床上得到了广泛的应用,逐渐代替了放射免疫分析。
简介
  时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术,是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10^(-12)g/ml[1] ,较放射免疫分析(RIA)高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。由于其高灵敏度,在临床上得到了广泛的应用,逐渐代替了放射免疫分析。[1] 
在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光,因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的,因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合,就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法(TRFIA)实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的,它是一种特殊的荧光分析。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响,同时,荧光分析与普通分光不同,光电接受器与激发光不在同一直线上,激发光不能直接到达光电接受器,从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。但是,当进行超微量分析的时候,激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此,解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短,激发光消失,荧光也消失。不过有非常少的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长,可达1~2ms,能够满足测量要求,因此而产生了时间分辨荧光分析法,即使用长效荧光标记物,在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。   平时常用的稀土金属主要是Eu(铕)和Tb(铽),Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定,但加入增强剂后可以克服;Tb荧光寿命1.6ms,水中稳定,但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解,因此从测量方法学上看Tb很好,但不适合用于生物分析,故Eu最为常用。
由于常用Eu作为荧光标记,因此增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理:利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在,使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂,在络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题,而使用了具有增强作用的新络合剂,因而有的试剂没有单独的增强剂。
随着检验医学的发展,对微量、超微量的测定会越来越多,同时RIA的污染问题会越来越被重视,因此,时间分辨荧光分析法(TRFIA)具有越来越大的应用空间。

划时代的检测技术

放射免疫分析(RIA),以其高度特异性灵敏度和实用性,吸引着各国的生物医学工作者,但操作中始终存在放射性污染、同位素半衰期短及试剂盒稳定性问题。为此,人们发展了一系列非放射性标记技术,如酶标记、化学发光、生物发光标记等技术,其中,时间分辨荧光免疫分析技术。由于灵敏度及线性范围明显优于其它技术,最为引人注目。
时间分辨荧光分析足以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超灵敏度检测技术,它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点。使非特异性信号降低到可以忽略的程度,达到了极高的信噪比,从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度,且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点,成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑。

标记物

采用镧系元素(铕、钐、镝、铽)进行原子标记,较碱性磷酸酶、吖啶酯、生物素等大分子标记物优势明显:原子标记,标记物更多,检测更灵敏,对被标记物的生物活性和结构无影响原子标记,标记稳定性强 多种标记,一个测试,多个项目。

检测特点

标记离子的荧光激发光波长范围较宽,发射光谱峰范围窄,是类线光谱,有利于降低本底荧光强度,提高分辨率。
激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移,有利于排除特异荧光的干扰,增强测量的特异性。
标记离子螯合物产生的荧光强度高,寿命长,有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。每一秒钟检测样品1000次,结果取平均值,有利于提高检测的准确性。

检测参数

灵敏度: 10-18 mol/well(Eu3+)
线性度: 10-18 ~ 10-12 mol/well(Eu3+)[2] 

TR-FIA应用

1.激素:甲状腺激素、甾体类激素。
2.病毒性肝炎标志物。
3.肿瘤相关抗原
4.药物。
5.多肽类。

TRFIA技术为临床检测带来的先进性

技术
特点
检验先进性
时间分辨
光谱分辨
特异性荧光与非特异性荧光分离
发射荧光与激发荧光分离
零背景、高特异性
解离-增强技术
荧光性大大提高,稳定的荧光螯合物
线性范围更宽,重复性更好
原子标记
标记位点多,可达20个;对标记物结果及活性影响小,无衰变,受环境影响小
高稳定性,试剂至少保质一年,标准曲线保留时间长,同一批次只需两点定标
多标记
可进行多标记
同一试剂盒可同时测多个项