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乙型肝炎患者血清病毒载量与 HBV M 定量及Pre-S1 抗原检测的相关性研究
作者:管理员    发布于:2014-06-09 06:52:15    文字:【】【】【
摘要: 测定HBV DNA 不同拷贝血清中乙型肝炎患者血清标志物(HBV M)及Pre-S1 抗原,探讨三者相关性及定量检测HBV M 的临床应用价值。

乙型肝炎患者血清病毒载量与 HBV M 定量及Pre-S1 抗原检测的相关性研究

王智华 1 张乐之2 吴淑梅2 方超平 2 李华良1 陈金弟 1
1. 福建南平解放军第92 医院检验病理科 353000
2. 第二军医大学附属长海医院实验诊断科 200433

目的:测定HBV DNA 不同拷贝血清中乙型肝炎患者血清标志物(HBV M)及Pre-S1抗原,探讨三者相关性及定量检测HBV M 的临床应用价值。
方法:荧光定量PCR(FQ-PCR)定量检测HBV DNA,时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)定量检测HBV M,ELISA 法半定量检测Pre-S1 抗原。
结果:HBV DNA 不同拷贝血清中HBeAg 检出率有显著性差异(P<0.01);
HBV DNA 拷贝数在102~103 copy/ul 时,病毒载量与HBV M 各项均无相关性(P>0.05);
HBV DNA 拷贝在104~106 copy/ul 时,与HBsAg、HBeAg 及Pre-S1 抗原成正相关(P<0.01=,与HBsAb、HBeAb 及HBcAb 无相关性(P>0.05);
HBV DNA 拷贝数≥107 copy/ul 时,病毒载量与HBsAg 及Pre-S1 抗原成正相关(P<0.01=,与HBsAb、HBeAg 、HBeAb 及HBcAb 无相关性(P>0.05);
不同病毒载量分组中HBsAg 与HBsAb,Pre-S1 抗原与HBsAg、 HBeAg、HBcAb均有相关性(P<0.01);
HBeAg 与HBeAb 在HBV DNA≤107 copy/u 时,成负相关(P<0.01=,HBV DNA≥107 copy/u 时无相关性(P>0.05);
HBsAg、HBeAg 荧光数及Pre-S1 抗原OD 值在不同病毒载量分组中的均值有显著性差异(P<0.01=。
结论:TRFIA 法定量检测HBV M 灵敏度高,可以更好地反映机体抗病毒免疫反应状况,监测处于转化期患者的病情和治疗效果,较早地提示肝炎慢性化进程;HBsAg、HBeAg 及Pre-S1 抗原可作为监测HBV 感染和复制的量化指标;Pre-S1 抗原与HBV DNA、HBsAg、 HBeAg 及HBcAb 均有相关性,亦可作为HBV 病毒感染和复制的良好指标。

乙型肝炎病毒血清标志物(HBV M)与HBV DNA 及Pre-S1 抗原间相关性的报道较少〔1〕,且HBV M 检测是采用ELISA 定性或半定量检测。本文采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)定量检测HBV M,探讨HBV M 的量是否与BV DNA 载量及Pre-S1 抗原半定量存在相关性,是否能反映机体在不同病毒载量时的抗病毒免疫反应状况,现报道如下。
1.对象与方法
1.1 标本来源
选自2004 年8 月我院专科门诊及住院患者血清HBV DNA 阳性(HBV DNA≥5×102copy/ul)标本66 例,其中男40 例,女26 例,年龄15—64 岁。收集血清标本置-20℃冷冻保存待检。
1.2 仪器
德国ROCHE 公司Lightcycler 荧光定量PCR 仪;
上海新波ANYTEST2000 时间分辨荧光分析仪;
芬兰Labsystem 酶标仪。
1.3 检测方法试剂
HBV DNA 采用FQ-PCR 定量检测,试剂选用深圳匹基公司生产乙肝病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒;
HBV M 检测采用时间分辨荧光免疫分析法,试剂选用上海新波公司生产乙肝血清标志物定量检测试剂盒;
Pre-S1 抗原检测采用ELISA 法,试剂选用中国科学院化学研究所研制,上海阿尔法生物技术有限公司生产试剂。
1.4 统计学分析
计数资料采用X2 检验,相关性用相关检验分析,成对双样本均值分析用t检验。
⒉ 结果
按HBV DNA 拷贝数将待测标本分三组:
Ⅰ组20 例:HBV DNA 拷贝在102—103 copy/u_l;
Ⅱ组26 例:HBV DNA 拷贝在104—106 copy/ul;
Ⅲ组20 例:HBV DNA 拷贝≥107 copy/ul。
因部分标本HBV M 浓度过低无计算值,故采用HBV M 荧光数及Pre-S1 抗原 OD
值进行统计处理。以上实验均严格按说明书操作。
2.1 三组中HBV M 阳性检出率见表1,三组中HBeAg 检出率有显著性差异(P<
0.01),其他各项在三组中的检出率无显著性差异(P>0.05)。

表1 三组患者血清HBV M 阳性检出率(%)2.2 HBV DNA 拷贝数与HBV M 各项荧光数及Pre-S1 抗原OD 值间相关系数及P 值见表2。Ⅰ组HBV DNA 与HBV M 及Pre-S1 抗原无相关性(P>0.05)。Ⅱ、Ⅲ组HBV DNA 与HBsAg、HBeAg 及Pre-S1 抗原成正相关(P<0.01=,因HBeAb荧光数与浓度成反比例故HBV DNA 与HBeAb 浓度成负相关(P<0.01=;HBV
DNA 与HBsAb 及HBcAb 无相关性(P>0.05)。HBV M 各项间及与Pre-S1 抗原间相关系数及P 值见表3,三组HBsAg 与HBsAb,Pre-S1 抗原与HBsAg、HBeAg、HBcAb 均有相关性(P<0.01=。Ⅰ、Ⅱ组中HBeAg 与HBeAb 有相关性(P<0.01=,但在Ⅲ组中HBeAg 与HBeAb 无相关性(P>0.05)。
2.3 三组患者血清中HBV M 及Pre-S1 抗原检测结果(以均值表示)见表4,HBsAgHBeAg 荧光数及Pre-S1 抗原OD 值在三组中的结果有显著性差异(P<0.01),其余项目无显著性差异(P>0.05)。

表2 不同病毒载量时HBV DNA 与HBV M 各项及Pre-S1 抗原间相关系数及P 值

表3 HBV M 各项间及与Pre-S1 抗原间相关系数及P 值

表4 三组患者血清中HBV M 及Pre-S1 抗原检测结果(X)

3.讨论
3.1 时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA),是用镧系元素标记抗原/抗体作为抗原-抗体反应体系示踪物,通过时间延迟和波长分辨将特异性荧光和非特异性荧光分辨开来,达到“零”本底,再根据特异性荧光强度和相对荧光强度的比值来判断反应体系中分析物浓度,达到定量分析的目的〔2〕。TRFIA 法具有高准确度、高灵敏度(可达10-19mol/L)、稳定性好、标准曲线线性范围宽、试剂有效期长、应用范围广〔1~3〕等特点,显示出良好的应用前景。
本文应用TRFIA 法检测HBV DNA 阳性血清中HBV M,结果表明HBsAg、 HBeAg及Pre-S1 抗原均有较高的阳性率。同时还检出13 例HBsAg 、HBsAb 及6 例HBeAg 、HBeAb 同时阳性血清。说明TRFIA 法定量检测HBV M 灵敏度高,可以更
好地监测处于转化期患者的病情和治疗效果,较早地提示肝炎慢性化进程。

观察发现HBeAg 在三组中检出率有显著性差异,说明病毒复制越活跃HBeAg越易于检出,支持传统观点认为HBeAg 是病毒复制及机体具有传染性的指标。Theilmann〔4〕、Neurath〔5〕等认为Pre-S1 抗原和HBV DNA 关系极为密切,Pre-S1
抗原可直接反应病毒活性和复制状态,而且Pre-S1 抗原与HBsAg,肝内HBCAg及HBeAg 滴度成正相关。我们的实验也支持这一观点。目前多数研究认为Pre-S1抗原检测比HBeAg 与HBV DNA 的关系更为密切,但我们在实验中发现Pre-S1 抗
原在HBV DNA 拷贝数<107 copy/ul 时检出率均高于HBeAg,但在HBV DNA 拷贝数≥107 copy/ul 时检出率低于HBeAg,与文献〔6〕有异,分析可能是因为ELISA法检测Pre-S1 抗原线性范围较小,在高浓度时易出现检测平台〔7〕,且 ELISA 法
检测影响因素多,易产生HOOK 效应,而本实验用TRFIA 法影响因素少,线性范围宽,在高浓度时亦不会出现检测平台,但具体原因还有待深入研究。
3.2 PCR 法检测HBV 病毒本身(DNA),能够准确、灵敏地反映HBV 的感染和治疗恢复情况,但因其实验条件要求严格、操作繁琐,不便于广泛开展。我们采用TRFIA 法定量检测HBV M,不但可以反映病毒复制情况还可以反映人体对HBV的免疫反应状态。同时我们在实验中发现在HBV DNA 拷贝数≥104 copy/ul 时病毒载量与HBsAg、 HBeAg 及Pre-S1 抗原具有正相关性,说明HBsAg、 HBeAg 及Pre-S1 抗原含量越高表明病毒在体内复制越活跃。张言超等〔8〕实验发现HBeAb≤3.0NCU/ml 时HBV DNA 检出率明显高于HBeAb≥3.0NCU/ml 时的检出率,且在复检中易出现反跳,提示HBeAb 低含量的病人可能存在转换不稳定的现象。我们在实验中观察到只有在HBV DNA 拷贝数≥104 copy/ul 时方与HBeAb 浓度成负相关亦支持此观点,同时还说明HBeAb 并非中和抗体,他的出现不能表明无传染性。

HBV DNA 拷贝数≥107 copy/ul 时病毒载量与HBeAg 无相关性,分析可能是由于HBeAg 高度可变,C 基因突变可形成一种不分泌HBeAg 的HBV 突变体,阻止HBeAg 形成或影响HBeAg 的分泌和抗原性,逃避了宿主免疫系统的识别和对病毒
的清除,实际上HBV 仍在复制〔9〕。
在HBV 不同载量组中HBsAg 与HBsAb 均成负相关,在HBV DNA 拷贝数<107copy/ul 时HBeAg 与HBeAb 荧光数成正相关,与浓度成负相关,说明HBV 的感染及复制情况与机体对HBV 的免疫反应状态具有一致性,即病毒复制活跃机体免疫
应答水平高,因此动态检测患者HBV M 各项量的改变有助于综合评价病毒复制及机体反应情况。Pre-S1 抗原与HBsAg、 HBeAg、HBcAb 均有相关性,与文献⑴报道一致,亦可作为HBV 病毒感染和复制的良好指标。

HBsAg、HBeAg 荧光数及Pre-S1 抗原OD 值在三组中均值有显著性差异(P<0.01),说明三者在数量上与DNA 拷贝数有良好相关性,可作为监测HBV 感染和复制的量化指标。

综上所述TRFIA 法检测HBV M 不但可以定量反映病毒感染及复制水平,还可通过动态监测抗原抗体量来反映机体对病毒感染的反应情况,为临床病程、观察疗效提供可靠而简便易行的依据。

参考文献
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200321(2):90-92
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〔4〕 Theilmann L,Klinkert MQ,Gmelin K,et al.Detection of Pre-S1 protein in serum
and liver of HbsAg-positive patients:A new marker for hepatitis B virus
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〔5〕 Neurath-AR,kent-SB,Strick-N,et al.Identification and chemical synthesis
of a host cell receptor binding site on hepatitis B virus Cell 1996,46(3):
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〔6〕 胡志东等,乙型肝炎患者血清标志物、前S1 蛋白和HBV-DNA 检测的相关性探讨〔J〕.
天津医药,2004,32(1):19-21
〔7〕 鞠北华等,解离增强时间分辨荧光免疫分析法检测HBV M 的临床应用〔J〕.江西医学
检验2003,21(3):200-201
〔8〕 张言超 寇海兵 朱学文.时间分辨荧光免疫法定量检测HBV 标志物的临床意义〔J〕.
齐齐哈尔医学院学报,2003,24(11):1213-1214
〔9〕 Yuki N,Hayashi N,Kataytma K,et al.Quantitative analysis of Pre-S1 and Pre-S2
in relationto HBSAg expression.Hepatology,1990,11:38-40
Abstract Objective:To investgate the relationship between HBV DNA
concentration and both serological markers,(HBV M)concentration and
Pre-S1 antigen, and to explore the significance of qualifing the HBV
serological markers, concentration. Methods: TRFIA was used to detect the
concentration of HBV M, Fluorescence-quantitative PCR was used to qualify
the HBV DNA concentration, ELISA was applied to the detection of Pre-S1
antigen. Results: the positive rates of different concentration of HBV
DNA were significant different(P<0.01= ; the correlations between
virus load and those indexes of HBV serology change with the virus
concentration. The fluorescence of HBsAg, HBeAg, as well as the optical
density of Pre-S1, was different among those groups of virus loud(P<
0.01=. Conclusions: TRFIA is a sensitive method for HBV M quantification,
which can monitor patient’s condition and therapeutic efficacy, and
suggest the prognosis of chronic hepatitis. HBsAg, HBeAg and Pre-S1
antigen can be monitor HBV infection and reproduce. Because of the
correlation between Pre-S1 antigen and those indexes, such as HBV DNA,
HBsAg, HBeAg, HBcAb, Pre-S1 antigen is a good index for monitoring HBV
infection and reproduce.





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