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时间分辨免疫荧光法和电化学发光法检测HBsAg 的对比分析
作者:管理员    发布于:2014-05-31 09:49:17    文字:【】【】【
摘要:乙肝是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏变质性炎症为主的一种传染病, 是世界范围内的常见病和多发病之一.

时间分辨免疫荧光法和电化学发光法检测HBsAg 的对比分析

欧翠华1 熊符1 陈健文2
中图分类号R446.62,R392.33 文献标识码A 文章编号1008- 0023(2007)02- 0099- 03

[摘要] 目的用电化学发光法作为标准, 探讨时间分辨免疫荧光法在检测HBsAg 上的应用。方法对临床348 份血清标本、一份HBsAg 高值梯度稀释血清及生物制品检定所标准血清分别用电化学发光法和时间分辨免疫荧光法分别检测, 比较两种方法检测结果的阴阳性符合率、灵敏性、特异性、准确性、线性范围以及阳性标本的定量相关性等。结果对临床348 份血清检测结果阴阳性符合率为98.26%; 阳性标本的定量相关性为γ=0.9641( P<0.001) ; 两种方法的线性范围, 时间分辨免疫荧光分析法约为1:2~1:2048 (0.21~223.07ng/ml), 电化学发光约为1:2~1:4096 (0.15~223ng/ml)。结论时间分辨免疫荧光法与电化学发光法在HBsAg 的定量检测上的灵敏性、准确性和线性范围都基本相当。

     乙肝是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏变质性炎症为主的一种传染病, 是世界范围内的常见病和多发病之一。我国在世界上属于乙型肝炎病毒感染的高发区, 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的携带者己超过10%。HBsAg 存在于HBV 的外壳部分, HBsAg 的检出是乙型肝炎的早期诊断指标之一, HBV 感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg, 其含量在5~600μg/m1 之间。据文献报道, 到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2ng/ml,含量高者可达2000μg/ml 以上[1]。定量分析HBsAg的浓度变化, 可预见急性乙肝是否处于恢复期, 对乙型肝炎的动态观测和病情监视、治疗具有积极的意义。目前国内最常用的HBsAg 免疫测定方法为酶联免疫吸附试验(ELISA), 其次是放射免疫试验(RIA)和电化学发光。ELISA 简单、方便、快速, 但其灵敏度、重复性不及电化学发光法, 易造成漏检和假阳性, 再加上酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响, 而导致结果稳定性不好; 而RIA 因其试剂半衰期短、废物难于处理及对环境的污染和身体的危害等, 使其使用受到很大局限; 电化学发光虽灵敏、稳定, 但其试剂价格昂贵, 也难以推广使用。而新近引进的时间分辨荧光免疫分析技术是目前世界上最先进的体外免疫检测技术之一。它以灵敏度高、线性范围宽、试剂有效期长、标准曲线稳定性好、易于自动化等优点是继酶联免疫分析、发光免疫分析之后, 于80 年代初问世的又一种非放射性的标记免疫分析技术[2,3]。在这项新技术中所用的镧系元素标记物和传统荧光素标记完全不同, 其中常用的铕、钐等稀土离子标记物具有超灵敏度、标准曲线剂量宽、标记物制备十分简易、稳定性高、在低温条件下保存三年以上不失活等优点, 因此倍受医学研究及临床检验工作者的青睐[4]。该技术在我国虽然起步较晚, 但科技工作者已经逐步致力于推广时间分辨荧光技术在医学上的应用。为了论证时间分辨荧光技术在乙型肝炎病毒检测方面的应用, 本实验则利用广州市丰华生物工程有限公司和中山生物有限公司联合研制的乙型肝炎病毒表面抗原时间分辨荧光免疫定量检测试剂盒和Roche 公司的ECLIA乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 诊断试剂盒, 对348 份临床标本以及中国生物制品检定所提供的定值血清进行了对比检测, 现将检测结果报告如下。

材料与方法

1 血清
1.1 受检标本为广州医学院第一附属医院检验科收集的各类病人血清, 检测前经乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒( ELISA) 初筛后, 保存于- 10℃。实验中随机抽取了348 份血样进行检测。
1.2 灵敏度标准品(adr 亚型)2 份为0.5ng/ml、1ng/ml 定值血清, 购自中国药品生物制品检定所。
1.3 稀释用小牛血清购自郑州佰安生物有限公司。
2 试剂
2.1 时间分辨免疫荧光定量检测试剂盒为广州市丰华生物工程有限公司和中山生物有限公司联合研制(批号: 20041203; 有效期: 20051203)。
2.2 Roche 公司的ECLIA 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 诊断试剂盒(批号: 16502301; 有效期:20051229)
3 检测用仪器
3.1 时间分辨免疫荧光定量检测试剂检测用时间分辨荧光检测仪: 1420 VICTOR2- D。
3.2 电化学发光定量分析表面抗原试剂盒所用检测仪: Roche Elecsys 2010 (Roche 公司) 。
1.4 方法
1.4.1 试剂操作按各自的说明书进行, 对临床348份标本进行定量检测比较两种方法的相关性; 将一份HBsAg 阳性高浓度血清用小牛血清作倍比稀释,用两种方法进行检测以比较各自的灵敏度及线性范围; 同时检测中国生物制品检定所提供的定值血
清来比较两种方法的准确性。
1.4.2 数据处理所有试验数据均使用SPSS 10.0软件进行统计分析。
结果
1 用时间分辨试剂与Roche 电化学发光试剂对348 分血清标本分别检测, 其定性结果见表1。

时间分辨试剂检测结果阳性判定值为>0.2ng/ml, 电化学发光试剂检测结果阳性判定值S/Co>1。
从表中可看出, 以Roche 电化学发光试剂为标准, 丰华公司与中山生物生产的时间分辨试剂与Roche 电化学发光比较, 灵敏度: 226/(226+4)×100%=98.26%; 特异性: 118/( 118+0) ×100%=100%; 假阳性率: 0/( 118+0) ×100%=0.00%; 假阴性率: 4/(226+4)×100%=1.74%, 两种试剂检测结果比较各项指标均无显著性差异( χ2=0.2, df=1, P>0.05) 。
2 两种试剂检测结果的相关性分析
以Roche 公司的ECLIA 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 检测试剂盒测出结果( S/Co>1) 为横坐标,以相应的丰华和中山生物生产的时间分辨乙型肝炎病毒表面抗原定量诊断试剂盒检测结果为纵坐标, 进行相关性分析, 结果见附图。其中γ=0.9641,P<0.001( n=226) 结果表明两方法呈高度相关。
3 用一份HBsAg 含量高浓度血清作倍比稀释,检测结果见表2。

从表中可看出同一份血清进行倍比稀释后, 每一稀释梯度均分别采用两种方法检测, 丰华和中山生物的时间分辨荧光免疫检测试剂的线性范围在1:2~1:2048( 相当于223.07ng/ml~0.21ng/ml) 之间, 稀释至1:4096 时, 超出了线性检测范围, 按丰华和中山生物的时间分辨检测试剂试剂盒要求, 检测结果为临床阴性; 而Roche 公司的电化学发光试剂检测线性范围也在1:2~1:4096 (223ng/ml~0.15ng/ml)之间, 其线性检测范围与丰华和中山生物提供的试剂基本相当, 其检测下限和低值范围稍优于丰华和中山生物的时间分辨荧光免疫检测试剂。
4 测定中国药品生物制品检定所提供的灵敏度adr 亚型0.2ng/ml、1ng/ml 血清结果见表3。

讨论
准确地了解乙肝病人体内HBsAg 的动态过程,可以帮助临床医生更清楚地掌握HBV 感染发生、发展和转归以及药物治疗效果等。然而, 在目前的HBsAg 定量检测试剂中都由于各种各样的缺点很难达到满意的程度。如酶联免疫方法灵敏度低、易
造成漏检和假阳性、易受环境因素影响导致稳定性不好; 放射免疫法存在试剂的有效期短及对环境辐射等问题; 电化学发光法又因试剂价格的昂贵而难以普遍推广使用等而局限了HBsAg 定量检测应用。新近发展起来的时间分辨荧光免疫分析技术无环境污染、高灵敏度( 酶联免疫为10~9mol/L、放射免疫为10~12mol/L、化学发光为10~15mol/L、电化学发光10~17mol/L、时间分辨荧光为10~18mol/L) 、稳定性好等特点而逐渐得到推广应用[4~6]。

从本实验检测结果来看, 丰华公司和中山生物联合生产的HBsAg 时间分辨免疫荧光定量检测试剂盒与Roche 公司生产电化学发光定量分析HBsAg试剂盒对临床348 份标本检测结果阴阳性符合率达98.26%, 其中电化学发光检测有4 份阳性标本
而丰华公司和中山生物生产的时间分辨免疫分析法检测为阴性, 理论上时间分辨试剂应比电化学发光有更高灵敏性, 此可从两种试剂的线性测定范围来分析看出, 丰华和中山生物的时间分辨荧光免疫检测试剂的线性范围在1:2 ~1:2048 ( 相当于223.07ng/ml~0.21ng/ml) 之间; 而Roche 公司的电化学发光试剂检测线性范围也在1:2~1:4096 (相当于223ng/ml~0.15ng/ml)之间, 其检测下限和低值范围比丰华和中山生物的时间分辨荧光免疫检测试剂较宽一些, 我们分析了这4 份不同结果的标本, 丰华和中山生物时间分辨试剂检测结果为0.15, 0.18,0.18, 0.16ng/ml, 判定结果为阴性( <0.2ng/ml) , 而Roche 电化学发光试剂检测结果为1.02, 1.08, 1.11,1.09, 判定结果为阳性( S/Co>1) , 说明丰华和中山生物时间分辨试剂盒在灵敏度上与国外试剂相比还有改进的地方, 此可能与国内试剂制备的原材料有关。

两种方法检测的阳性标本在定量关系上呈高度相关( γ=0.9641, P<0.001) , 在灵敏性、特异性、准确性、线性范围等都基本相当, 但加上时间分辨试剂的开放性及经济性和国产有自主产权等优点, 将在我国乙肝定量检测、疗效观察以及血液筛选中尤
其是在低水平血清乙肝病毒表面抗原检测中得到广泛应用。但是从本实验也可看出, 时间分辨在线性范围上只有200ng 左右, 对于高浓度标本, 仍难以达到精确定量, 建议作一定稀释后再做检测, 方可得到准确定量。
参考文献
[1] 谢志贤,董莹,艾桂萍,等.乙肝病毒DNA 与乙型肝炎表面抗原含量的探讨[J].陕西医学检验,2000,15(2):40.
[2] Barnard G. Time- resolved fluorescence immunoassay. In: Edwards R, ed. Immunodi - agnostics: A practical approach[M]. Oxford: OxfordUniversity Press,1998.
[3] 潘利华,杜继贤,谢文兵,等.时间分辨激光荧光光谱技术在免疫分析中的应用[J].光谱学与光谱分析,2000,20(3):277~279.
[4] Hemmila I, Dakubu S, Mukukala VM, et al. Europuim as a label in time- resolved fluoroimmunoassay[J]. Anal Biochem,1984,137:335~334.
[5] 李振甲,陈泮藻,高平,等编著.时间分辨荧光分析技术与应用[J].科学出版社,1996.
[6] Siitari H, Hemmila I, Soini E, et al. Detection of hepatitis B surface antigen using time- resolved fluoroimmunoassay[J]. Nature, 1983,301:258~260.





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