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时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用
作者:管理员    发布于:2014-04-25 02:04:47    文字:【】【】【
摘要:标记免疫分析技术的出现使临床生化分析由常量分析向微量分析转变。20 世纪80 年代 出现的时间分辨荧光免疫分析技术,以其独特的优势成为最有发展前途的非放射免疫标记技术。本 文主要介绍时间分辨荧光免疫技术基本原理、基础试剂、基本技术以及近年来临床应用。

 时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用
武学成1 ,2
(综述) ,何 林1 ,周克元2
(审校)
(1. 深圳人民医院检验医学部,广东深圳518001 ; 2. 广东医学院,广东湛江524001)

随着生物标记技术的不断进步,免疫分析技术得到了长足的发展。免疫分析技术逐步由放射免疫分析技术向非放射
免疫技术转变。在此期间,涌现了一大批非放射免疫技术,例如酶免分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫
分析技术(time2resolved fluoreimmuoassay ,TRFIA) 等。但是从灵敏度来说只有时间分辨荧光免疫分析技术可与放射免疫媲
美。TRFIA 是20 世纪80 年代迅速发展起来的的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术。
1  时间分辨荧光免疫分析技术的基本原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液
(有一部分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀
伤反应等) 发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系
中分析物的浓度,达到定量分析的目的。
2  时间分辨荧光分析技术简介
TRFIA 的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、分析缓冲液、增强溶液。基本技术包括包被技术、标记技术、
反应模式。
2. 1  基础试剂
2. 1. 1  示踪剂的选择和使用 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的ⅢB 族,包括钪( scandium ,SC) 、钇(yttrium ,Y)
和镧系元素。到目前为止,只有铕(europium ,Eu) 、铽(terbium ,Tb) 、钐(samarium ,Sm) 、钕(neodymium ,Nd) 、镝(dysprosium ,Dy)等5 种被用作TRFIA 示踪剂,尤以Eu3 + 常用。一般用Eu2O3制备成EuCl3 ,再经纯化和常温真空抽干,然后干燥保存。用Eu3 + 等镧系元素作为示踪剂有以下特点: ①荧光物质激发光谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的差,称为Stokes 位移。普通荧光物质荧光光谱的Stokes 位移只有几十纳米,激发光谱和发射光谱通常有部分重叠,互相干扰严重。游离铕的荧光信号虽然相当微弱,但当Eu3 + 与螯合剂形成螯合物时,产生分子内和分子间能量传递,使Eu3 + 的荧光强度显著增强, Stokes 位移达200nm ,很容易分辨激发光和发射光,从而排除激发光干扰; ②镧系元素与普通的荧光团比较,镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间(decay time) 长,为传统荧光的103~106 倍。稀土离子及一些常见荧光物质的荧光寿命(见表1) 。镧系元素的荧光不仅强度高,而且半衰期也很长,介于10~1 000μs 之间。这样,用时间分辨荧光仪测量Eu3 + 螯合物的荧光时,在脉冲光源激发之后,可以适当的延迟一段时间,待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量,这时就只存Eu3 + 标记物的特异性荧光,即通过时间分辨,极大地降低了本底荧光,实现了高信噪比,这是TRFIA 高灵敏度和低干扰的原因之一。如果在使用链霉亲合素2生物素系统,可更好地降低非特异性荧光的干扰[1 ] ; ③镧系螯合物激发光光谱较宽,最大激发波长在300~500nm ,可通过增加激发光能量来提高灵敏度。而它的发射光谱带很窄,甚至不到10nm ,可采用只允许发射荧光通过的滤光片,进一步降低本底荧光; ④Eu3 + 等镧系标记物与放射性同位素相比不受半衰期的影响。如125 I 标记试剂最长可用3个月,酶标记物常因其纯度、显色底物不稳定等问题,使其应用受到限制。Eu3 + 与双功能螯合剂螯合,可形成稳定的螯合物,稳定性很高,2 年内能保证质量。再者, Eu3 + 标记物体积很小(为原子标记) ,标记后不会影响被标记物的空间立体结构,这既保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小) ,又可实现多位点标记[2 ] 。标记物稳定就可以对标记物进行多次激发,通过对每次激发的荧光信号累加后取平均值的办法,可大大减少偶然误差,提高准确度。同时多位点标记技
术,不仅使检测更灵敏,也使一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目。
2. 1. 2  稀有元素双功能螯合剂 稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能基
团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连接,一端与抗原或抗体的自由氨
基(组氨酸、酪氨酸) 连接。目前常用镧系元素标记的双功能螯合剂有异硫氰酸2苯基2二乙胺四乙酸( ICB2EDTA) 、β2萘甲酰三氟丙酮(β2NTA) 、二乙基三胺五乙酸环酐(DTPAA) 、4 ,72二氯磺基苯21 ,102菲罗啉22 ,9 二羧酸(BCPDA) 及对2异硫氰酸2苄基2二乙三胺四乙酸(P2ICB2DTTA) 等5 种。Yuan 等[3 ] 合成出一种稳定的能发出强烈荧光的Eu3 + 络合剂4 ,4′2 二(1 ,1′,2 ,2′,3 ,3′2 七氟24′,6′2 己二酮26′2 基)2氯磺酰2邻三联苯(BHHCT) ,可以作为标记物直接固相检测,已用固相TRFIA 法测定甲胎蛋白(AFP) 、IgE、促甲状腺激素( TSH) 等, 其灵敏度有极大提高[3 ,4 ] 。Wu 等[5 ,6 ] 在Yuan 工作的基础上合成两种新螯合物,其中一种已用于T4 的检测。国内潘利华等[7 ] 利用自建的分析方法,在一定条件下使BCPDA 与铕离子形成稳定的BCP2DA2Eu3 + 2(HBsAb) IgG标记物,测定了标记过程的有关参数,并对标记物的某些光学特性进行了研究。赵吉力等[8 ] 成功地制备时间分辨荧光免疫分析双功能螯合剂BCPDA ,并建立Eu3 + 2BCPDA2蛋白质标记物中蛋白质浓度的测定方法。

2. 1. 3  增强溶液 TRFIA 主要是解离增强镧系免疫分析技术(dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay ,DELFIA) 之所以具有极高的检出灵敏度,主要原因除测量仪器外,荧光增强效力是一个十分重要的因素。免疫反应后所形成的复合
物,在弱碱性缓冲液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所产生荧光的淬灭
剂。所以要加入一种增强液。增强液一般由β2二酮体、三辛基氧化磷(TOPO) 、TritonX2100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH 2. 0~3. 2) 组成。酸性增强液使铕离子从螯合物中解离下来,游离的Eu3 + 在三辛基氧化磷协同下,重新与β2二酮体形成一种
新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在激发光激发下,铕离子获能,经过电子跃迁并返回基态,可发射极强的荧光信
号。目前,增强液中使用的β2二酮体类螯合剂效果最佳的是β2萘甲酰三氟丙酮(β2NTA) ,其灵敏度可达16 ×10 - 18mol 。以
β2NTA为例,说明增强液的原理。增强液中TritonX2100 非离子型的表面活性剂可以有效地将Eu3 + (β2NTA) 3 (TOPO) 2 复合物形成大分子的微囊,微囊的内侧为疏水性基团能有效地溶解脂溶性的β2NTA ,外层为亲水性基团,可以和水分子结合。这
种微囊可最大限度的将能量传递给Eu3 + ,从而阻断了β2NTA吸收能量传递给水所产生的淬灭效应。其中β2二酮体起关键
作用,三辛基氧化磷是一种荧光增强协同剂。在多标记测定中,引入了共用荧光增强液主要是在原有的β2二酮体系统中
加入了少量稀土离子Y3 + 、Tb3 + 或Gd3 + ,从而使系统的荧光强度大大增强。
2. 2  基本技术
2. 2. 1  包被技术 TRFIA 包被技术,是保持其灵敏度重要因素,因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯化,以提高抗
体的包被量和均一性。国内外最早的使用的包被的缓冲体系为pH 9. 6 的碳酸盐缓冲液,90 年代后改为柠檬酸缓冲液,pH
为4. 5 ,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。包被抗体前,将聚苯乙烯微量滴定条先在室温下用0. 25 %戊二醛处理20min ,能够显著提高抗体包被量,增大标准曲线范围,在包被甾体激素2蛋白质结合物时,不必进行封闭,直接加入无水乙醇固定,蛋白虽然变性凝固但牢固的结合在孔内,而连接到蛋白上的甾体激素免疫活性没有改变,可以长期保存。
2. 2. 2  标记技术 ①抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白质的反应性依
赖于蛋白表面的游离氨基酸数目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基酸数目越大,蛋白质的特异等电点越高,蛋白
质易与螯合剂反应,从而产生较高的标记率,但其标记比率与免疫反应不成正比关系。标记抗原(抗体) 上的自由基团主要
是2NH+4 和2COO- ,双功能螯合剂应能与2NH+4 和2COO- 相连,一侧基团与铕离子螯合。最常用的标记方法是多肽或抗体2
IgG2Eu3 + 的标记, 主要使用P2ICB2DTTA2Eu3 + 和ICB2EDTA2Eu3 + 双功能螯合剂形成Eu3 + 2螯合剂2抗体复合物,结合反应动力学,标记率依赖反应体系的pH 值、温度和时间,标记条件以pH 9. 0~9. 3 的标记结合率最高,反应时间以14~24h ,
温度以(10 ±2) ℃为宜,螯合剂2Eu3 + 与IgG的可分之比以80~320 倍为高。生物素2亲合素系统与荧光标记方法结合
(Eu3 + 2SA2BI2xIgG) 建立一种超灵敏度的检测方法,可用于肿瘤标志物、多肽类激素和甾体类激素检测。一个IgG分子联
结4~5 个生物素分子是适宜的,半抗原衍生物生物素化,每个分子联结1~3 个生物素分子可满足检测的灵敏度; ②镧系
离子Eu3 + 可用来标记核酸探针。将DNA 探针上耦联半抗原,当杂交后,加入一抗,产生免疫反应,再加入Eu3 + 标记的二抗
IgG,最后同过检测Eu3 + 荧光强度来对DNA 定量。应用ICB2EDTA 与BSA 系统标记DNA 探针,已用于临床血清样本检测。
在PCR 扩增检测产物的同时将Bio2dUTP 掺入到产物中,用SA2Eu3 + 与Bio2PCR 产物结合,洗去未结合物,测量荧光强度,
可用来检测基因缺陷。③Leinonen 等[9 ] 最早用Eu3 + 和Sm3 +双重标记分析了PSA。Eu3 + 和Sm3 + 是常用于双标记分析的一对稀土离子,在增强液中加入稀土离子Y3 + 协同剂邻非罗啉,在不同发射光波长下,用荧光计同步测定Eu3 + 和Sm3 + 的
荧光强度,有利于提高灵敏度,也可检测同一样品中两种以上的抗原或抗体,Y3 + 能使Eu3 + 和Sm3 + 的荧光信号大大加强。
2. 2. 3  反应模式 目前常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。①双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决
定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 + 标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3 + 从复合物
上完全解离下来,在Eu3 + 的增强液中与另一种螯合剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3 + 包裹于其内部的微胶囊
(胶态分子团) 。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于测定蛋
白质类大分子化合物。②固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原化合物,因分子质量小,不能直接进行固相包被,如多肽、
甲状腺激素类和一些药物等,都必须经过化学耦联剂与载体蛋白质进行共价键结合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定条孔
壁,制成固相抗原。其原理是:限量固相抗体与Eu3 + 标记抗原和样品中的待测抗原竞争性结合,样品中的抗原浓度越高,
固相抗体结合的Eu3 + 标记抗原量就越少,反之亦然,即固相抗体上的荧光信号强度与样品中的抗原浓度成反比。
3  TRPFIA的应用

3. 1  在免疫学的应用 ①测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过程中起重要
作用。因此,准确测定细胞因子含量,对于了解它们病理生理作用是十分重要的。1992 年用TEFIA 方法测定肿瘤坏死因子
(TNF) 和白细胞介素6 ( IL26) ,在细胞因子测定方面TRFIA 逐渐开始取代RIA 和EIA; ②测定补体:补体成分在多种自身免
疫性疾病中起作用,临床上常检测补体C3 来评价免疫系统的功能,1993 年出现了检测补体C3 的TRFIA 试剂盒,可测定脑
脊液中补体C3 。
3. 2  在微生物方面的应用 由于TRFIA 的方法灵敏度高,在1979 年它的理论形成后,研究重点放在试剂开发和利用上,
早期主要研制微生物诊断试剂。在1982 年研制出用于测定风疹病毒抗体TRFIA 的试剂。在1986 年开创快速诊断流感
的TRFIA 方法。Sorensen[10 ]在2002 年临床化学杂志发表了关于同时检测弓形体IgM和IgA 抗体TRFIA 方法,并筛查新生
儿弓形体发病情况。
3. 3  分子生物学的应用 铕标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核酸杂交整个过程变得快速、简单。目前,稀土元
素标记探针技术已用于检测HIV、检测前列腺特异性抗原(PSA) 的mRNA、腺病毒DNA、肺炎链球菌DNA 和HLA227 等位
基因,获得了满意的结果。
3. 4  在激素方面的应用 Storch 等[11 ] 用TRFIA 检测人血清胰岛素含量,相继Stenman 等[12 ] 用它检测了hCG。Wu 等[13 ] 检测了血清中的甲状腺激素等。TRFIA 不仅用来检测人血清激素,国外还用它检测动物的激素,例如Ogine 等[14 ] 检测了猪的松弛肽。Parra 等[15 ] 报道用时间分辨荧光免疫分析检测犬血清中的皮质醇和FT4 等。Kohek 等[16 ] 用TRFIA 分析血清、ED2TA 抗凝血浆和柠檬酸钠抗凝血浆激素(LH、FSH、PRL、T4 、GH、Ins、FT4 、TSH、TT3 等) 含量差别,发现只有在分析促甲状腺激素(TSH) 、胰岛素( Ins) 、TT3 、雌二醇( E2 ) 、Testo (睾酮) 和Prog(孕酮) 时柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。Harma 等[17 ] 改进了TRFIA 测定PSA 的方法。现在TRFIA 已经取代RIA、EIA 等方法,检测项目涉及甲状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌素等各个方面。
3. 5  其他方面 Qin 等[18 ] 报道了一种TRFIA 测量尿微量白蛋白的方法,仅仅需要12min。Kurogochi 等[19 ] 报道了荧光标
记β2半乳糖苷酶机制及其运用。有研究[20 ] 用TRFIA 对细胞内的溶酶颗粒中Perforin 蛋白进行定量测定。
4  展 望
由于TRFIA 技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身:灵敏度高、特异性强、稳定性好,且测定范围更宽,试剂寿
命长,操作简便和非放射性等特点,非常适用于生物学、医学上的超微量分析,是一项很有前途的、值得推广的技术,其应
用范围不断发展已经成为临床及治疗监测和基础医学研究等方面的重要手段。国外该项技术已经成熟,我国近年来检测
项目也不断增多,目前已经推出几十种商品化的试剂盒。随着国内、外对TRFIA 深入研究,必将使标记免疫学技术在医学
上大放异彩。
(致谢:感谢潘利华老师对本研究工作的指导)参考文献:
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