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乙型肝炎病毒感染血清标志物定量研究方法评价
作者:管理员    发布于:2014-04-21 09:02:09    文字:【】【】【
摘要:乙型肝炎(乙肝) 是目前临床上的常见病、多发病,其传 染性强、传播途径复杂,严重影响人们身心健康。用ELISA 法对HBV 抗原抗体定性检测只能供给我们“阳性”“阴性”结 果,对于HBV 感染的严重程度、用药疗效及预后判断,不能 提供一个客观的量化指标[1 ] 。时间分辨荧光免疫技术(TR2 FIA) 是近年新建立的一种定量技术,具有高灵敏度、高特异 性等优点,逐渐用于临床对乙肝五项进行定量分析。本研究 拟对TRFIA 定量测定乙肝五项的方法做一评价。

乙型肝炎病毒感染血清标志物定量研究方法评价
胡慧梅,赵克斌
(山西医科大学第一医院,山西太原 030001)
  乙型肝炎(乙肝) 是目前临床上的常见病、多发病,其传染性强、传播途径复杂,严重影响人们身心健康。用ELISA
法对HBV 抗原抗体定性检测只能供给我们“阳性”“阴性”结果,对于HBV 感染的严重程度、用药疗效及预后判断,不能
提供一个客观的量化指标[1 ] 。时间分辨荧光免疫技术(TR2FIA) 是近年新建立的一种定量技术,具有高灵敏度、高特异
性等优点,逐渐用于临床对乙肝五项进行定量分析。本研究拟对TRFIA 定量测定乙肝五项的方法做一评价。
1  资料与方法
1. 1  试剂和仪器 乙肝五项定量试剂为上海新波生物技术有限公司生产的诊断试剂盒;仪器为美国Ptrkin2Elmer 公司生
产的1235 自动DELFIA 仪;乙肝五项定性试剂为上海荣盛生物技术有限公司生产的诊断试剂盒;酶标仪为美国生产的
Model2450 型酶标仪。
1. 2  标本来源 来自本院检验科乙肝五项定性为大三阳的标本;混合血清做灭活处理后分装- 20 ℃保存。
1. 3  实验方法 乙肝五项定性采用ELSIA 检测,为酶免快速一步法,严格按照说明书操作,结果判定:HBsAg 和HBeAgS/ CO ≥2. 1 为阳性(阴性对照的吸光度值小于0. 05 按0. 05计算) ,在所有ELSIA 检测中未发现任何一次阴性对照的光
度值大于0. 05 ,因此实际判断值以吸光度值/ 0. 105 ≥1 为阳性。HBcAb 的临界值为:阴性对照的吸光度值×0. 5 ,实际判
断值以吸光度/ 临界值< 1 为阳性,记录每份标本的S/ CO值。乙肝五项定量测定采用TRFIA , 又称解离增强技术
(DELFIA) ,严格按照说明书操作,每块板均带一套标准品,每个标准品均做双孔。标准品浓度分别为:HBsAg(ng/ mL) :0 ;
0. 2 ;1 ;5 ;25 ;150。HBeAg (NCU/ mL) :0 ;0. 03 ;0. 12 ;0. 5 ;2 ;8。HBcAb(NCU/ mL) :0 ;0. 08 ;0. 2 ;0. 6 ;2 ;8。
标准曲线采用Multicalc 软件拟合曲线,以荧光计数值的对数值做纵坐标,以标准品浓度的对数值做横坐标,建立标
准曲线。结果≥临界值则判为阳性: HBsAg ≥0. 2 ng/ mL、HBeAg ≥0. 03 NCU/ mL、HBcAb ≥2. 85 NCU/ mL。
 临床医药实践杂志  2005年 8月第14卷第 8期   ·603 ·
2  实验结果
2. 1  对比实验 84 例随机标本用两种方法同时测定,记录各自的检出率。HBsAg、HBeAg、HBcAb 三项指标的符合率为
100 % ,各检出大三阳标本8 例。
2. 2  重复性实验 批内重复性实验取上述大三阳标本分别进行定性和定量检测,连续测定20 孔,并同时测定购自卫生
部的HBsAg(1 ng/ mL) 质控品。计算各自批内的均数、标准差及变异系数,了解批内重复性,各项检测结果见表Ⅰ。批间
重复性实验取上述大三阳标本分别进行定性和定量检测,连续测定15 d ,每天测1 次,每次测2 份,取平均值,并同时测定
HBsAg(1 ng/ mL) 质控品。计算各自批间的均数、标准差及变异系数,了解批间重复性,各项检测结果见表Ⅱ。



2. 3  灵敏度试验 取购自卫生部的质控品HBsAg (1 ng/mL) ,用阴性血清做一系列稀释,用两种方法同时测定。用
ELSIA 法做定性检测, 其最低检出浓度为0. 5 ng/ mL , 用DELFIA 法做定量检测,其最低检出浓度为0. 15 ng/ mL。
2. 4  回收实验 取上述大三阳患者标本加入HBsAg 的定值标准品,用DELFIA 法对HBsAg 做定量检测,其回收率为98.
6 %。
3  讨  论
3. 1  测定方法特点 乙肝五项定量测定采用时间分辨荧光免疫分析技术,该技术主要应用的是镧系元素的特点[2 ,3 ] :
原子标记技术,用镧系元素“铕”作为示踪物,标记物体积小,对被标记物的空间结构和活性影响小;时间分辩标记物“铕”
的荧光寿命长,延缓测量时间等待测样品中的自然荧光完全淬灭后,再测定“铕”的荧光信号,这样就消除非特异性荧光
的干扰,提高了检测灵敏性;波长分辨,镧系元素的发射光和激发光波长间的stokes 位移大,有利于排除干扰,提高测量的
分辨率;解离增强技术,正常情况下,示踪物铕所发出的信号极微弱,加入一种酸性增强液后,铕就会从免疫复合物中解
离出来,形成新的螯合物,当被激发光激发后,则会发出极强的荧光信号,便于检测。
3. 2  影响因素 DELFIA 的主要影响因素是大自然中存在的稀土类物质[4 ] ,其主要来源有空气中灰尘、反应容器、试验用蒸馏水等。因此做试验时必须保证实验室防尘,尽量使用洁净的一次性用品,并注意对仪器的日常维护与保养。
3. 3  测定方法比较 目前乙肝五项的定性检测大多采用ELSIA 一步法,虽然一步法简单快速,但当标本中的待检物质浓度过高时会因沟状效应(Hook) 现象出现假阴性结果,而造成漏检;而DELFIA 是两步法,避免了假阴性结果的出现。乙肝五项的定性检测大多为手工操作,易受实验室条件或其他人为因素的影响;时间分辨荧光免疫分析技术属全自动化检测仪,能提供稳定均一可靠的试验条件,避免由人为因素所引起的加样误差。与ELISA 定性相比,用DELFIA 定量测定乙肝五项指标给了临床一个量化指标,使结果更直观,尤其在药物疗效观察方面,更显出其重要性。且时间分辨率荧光免疫技术具有较高的特异性和灵敏度,全自动操作,减少人为误差,使检测结果更加稳定可靠。
参考文献:
[1 ] 张增荣,朱海滨. 乙型肝炎病毒前S1 抗原检测及临床
应用[J ] . 临床医药实践,2004 ,13(4) :263~264.
[2 ] 王兰兰,主编. 临床免疫学和免疫检验[M] . 第3 版.
北京:人民卫生出版社,2003. 235.
[3 ] 陈永伟,黄 飚,肖华龙,等. 抗HBc 时间分辨荧光免
疫分析法的建立[J ] . 临床检验杂志,2002 ,20 (5) :291
~292.
[4 ] 顾爱萍,朱雪明,单卫民,等. 丙型肝炎病毒抗体的时
间分辨荧光分析法检测[J ] . 临床检验杂志,2001 ,19
(4) :215.
收稿日期:2005204219作

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